百萤讲堂之Annexin V-iFluor 633符号试验计划

  Annexin V-iFluor 633符号是用于检测细胞功用的探针，膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白宗族。 它们富含真核生物，归于参加信号转导的普遍存在的细胞质蛋白宗族。 膜联蛋白V的优先结合爱人体是磷脂酰丝氨酸（PS），其一般保持在细胞膜的内叶（细胞质侧）。 在细胞凋亡中，PS被转移到质膜的外部小叶。 磷脂酰丝氨酸在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中心阶段的通用指示，并能在调查到形状改变之前检测到。 咱们的膜联蛋白V结合物是一组监测细胞功用的东西，旨在通过丈量磷脂酰丝氨酸的易位来监测细胞凋亡。

  膜联蛋白V结合物在Ca2+存鄙人与凋亡细胞表面上的PS结合，它也能够终究靠坏死细胞膜或死细胞并与细胞内部的PS结合。 因而，咱们提议将细胞不行浸透的核染色与膜联蛋白V结合物结合运用，以区别死细胞和凋亡细胞。

  1.2用测验化合物处理细胞一段所需的时刻（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

  1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自过程1.1）。

  1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜剖析细胞之前，参加300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自过程1.1）以添加体积（拜见下面的过程1.8）。

  留意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术剖析未常常检测，由于在细胞别离或收成期间有几率产生特定的膜损害。 但是，Casiola-Rosen等人从前报导了运用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的办法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。

  3.1移取过程1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自过程1.1）冲刷1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自过程1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

  留意：关于粘附细胞，主张直接在盖玻片上成长细胞。 与膜联蛋白V组合物孵育（过程1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自过程1.1）冲刷1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自过程1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并调查细胞。 在与膜联蛋白V组合物孵育后，细胞也能够在2％甲醛中固定，并在显微镜下调查。

  下图是运用流式细胞仪检测膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸在Jurkat细胞凋亡中的结合活性的实例。 在活的非凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450检测非诱导细胞中的先天性细胞凋亡，其一般为一切细胞的2-6％。 在凋亡细胞中，膜联蛋白V-mFluor Violet 450与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸坐落细胞膜的外部小叶上，导致染色强度添加。